四虎影视在线影院在线观看免费视频,天天躁日日躁狠狠躁av麻豆,熟妇高潮一区二区三区,亚洲欧洲精品成人久久av18,成年无码一区视频,不卡无码av一区二区三区,亚洲国产成人久久综合碰,久久国产免费福利永久
Case
Home Case 提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機實驗案例
2020/12/21 12:03:21
提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機實驗案例
Source:Shanghai Jingxin

組織樣品中RNA的提取實驗:本實驗的組織樣品主要有小鼠的各個組織器官(如肝臟,肌肉,脂肪等)和人腫瘤標本(如結直腸癌,肺癌,乳腺癌)

1.首先要根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的TRIZOL液體,同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下:(小鼠組織加入TRIZOL,結直腸癌標本加入TRIZOL)

注意:

a.用凈信勻漿機進行勻漿處理時樣品體積最好不要超過TRIzol體積10℅)

b.需事先預冷試管座

2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行

3.機器運行完畢后,打開蓋子,拿出凈信EP管仔細觀察組織的研磨情況,如果沒有明顯的塊狀物,那就可以進入下一步實驗步驟,如果沒有完全打碎,還需要把EP管放入試管座中,繼續勻漿。有些堅硬,或者脂肪含量高的組織(乳腺)可能需要稍微長一點的時間,時間可以依據組織實際的研磨情況來調整勻漿時間。

4.和傳統的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。

5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩若干秒,室溫放置幾分鐘。

6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。

7.把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇,室溫放置幾分鐘。

8.2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘,棄上清。

10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。

常見問題分析:

1得率低:

A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

B.RNA沉淀未完全溶解

C.檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

D.樣品勻漿時加的試劑量太少

E.勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘

F.吸取水相時混入了有機相

2 RNA降解

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C.細胞在用胰酶處理時過度

D.溶液或離心管未經RNase去除處理

E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

3 DNA污染:

A.樣品勻漿時加的試劑量太少

B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

預防RNase污染注意事項:

1.經常更換新手套,皮膚上常帶有的細菌,霉菌可能成為RNase的來源。

2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染,但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4.配制溶液應使用無RNase的水

本實驗已經研磨的各個組織中發現肝臟組織是最容易研磨,研磨效率是最好的。

下圖A是RNA經過傳統的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖,結果很明顯發現這種方法是可行的,是可以代替傳統的方法的。

下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發現在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。

圖C是利用組織勻漿器對人結腸癌標本進行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。

圖D是小鼠的肝臟組織經過手工研磨和機器勻漿后,最后抽提得到的RNA進行了濃度的測定,結果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統的手工的方法得到的RNA。

蛋白質的提取

A.根據需要抽提的組織樣品的質量加入相應的蛋白質裂解液(如RIPA),同時加入3顆不銹鋼柱。(小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液,人結直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液)

B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預冷好的試管座中。機器設置好參數蓋上蓋子,點擊運行。

以下同上RNA的操作方法

最終所得到的蛋白質濃度的測定經過BCA試劑盒測定完成的,同時通過SDS-PAGE后經過考馬斯亮藍染色和western blot檢測都發現其要比傳統的方法更加簡便快捷,不容易引起交叉污染。

更多實驗細節可致電工作人員!

主站蜘蛛池模板: 久久精品农村毛片| 欧美乱妇高清免费96欧美乱妇高清| 秋霞人妻无码中文字幕| av最新高清无码专区| 亚洲自偷自拍另类第1页| 2019午夜三级网站理论| 国产亚洲精品久久精品69| 波多野结衣超清无码专区| 欧美成人精品一区二区三区色欲 | 精品乱码无人区一区二区| 日本无码人妻波多野结衣| 欧美成人精品三级一二三在线观看| 精品 在线 视频 亚洲| 亚洲国产欧美在线观看片| 丰满少妇被猛烈进出69影院| 巨茎爆乳无码性色福利| 永久免费的av在线网无码| 久久精品一区二区三区av| 精品乱码无人区一区二区| 精品久久久无码中字| 免费无码又黄又爽又刺激| 久久婷婷五月综合色和啪| 手机看片国产av无码| 小泽玛利亚一区二区免费| 伊人精品成人久久综合全集观看| 99久久久无码国产精品动漫| 99精品国产福利一区二区| 成年入口无限观看免费完整大片 | 中文字幕欧美亚州视频免费| 黑人大战日本人妻嗷嗷叫| 亚洲一区av无码少妇电影玲奈| 无码国产偷倩在线播放老年人| 51久久国产露脸精品国产| 国产精品内射视频免费| 亚洲国产精品久久久久秋霞小说 | 玩弄人妻少妇老师美妇厨房| 久久亚洲男人第一av网站| 国产农村乱子伦精品视频| 久久99精品网久久| 精品三级久久久久电影网| 国产成人无码av在线播放无广告|